Nemli sıcak uygulaması, kuru sıcak uygulamasına göre daha etkilidir. Yüksek sıcaklıktaki ısıl işlemin mikroorganizmaları öldürdüğü açıktır. Burada nemli ve kuru sıcak uygulaması arasındaki fark, sadece ısı enerjisinin iletilmesidir. Su buharı, ısı enerjisini kuru havaya göre çok daha iyi bir şekilde ilettiği için sterilizasyonda çok daha etkilidir. Buna göre sterilizasyon etkisi, nemli sıcak uygulamalarında 121 0C’de 15 dakikada, kuru sıcak hava uygulamalarında ise
170 0C’de 2 saatte sağlanabilmektedir.
Basınçsız Buhar ile Sterilizasyon
Kaynatma
Bazı besiyerleri ve malzemeler otoklavda sterilize edilemez. Aşırı ısıtma bazı besiyerlerinin performansını olumsuz yönde etkiler. Örneğin VRBA besiyeri sadece kaynar su banyosunda 30 dakika tutularak sterilize edilir. Bu süre, besiyeri merkez sıcaklığının 95– 98 0C’ye çıkması ve bu sıcaklıkta birkaç dakika kalması için yeterlidir.
Mikrodalga fırın, kaynatmak amacı ile kullanılabilir. Bu işlemde besiyerinin taşması önlenmeli, fırın ara sıra çalıştırılarak sıcaklık hep kaynama sıcaklığına yakın tutulmalıdır.
Tindalizasyon
Otoklav arızalı ise ya da doğru çalıştığından endişe ediliyor ise tindalizasyon uygulanabilir. Bu amaçla besiyeri ya da çözelti, kaynar su banyosunda 80 0C’de 1 dakika tutulup oda sıcaklığında 1 saat beklenir. Sonra kaynar su banyosunda kaynama sıcaklığında (95–98 0C) 30 dakika tutulur ve hızla soğutulup oda sıcaklığında 8 saat bırakılır. Bu işlem 2 kez daha (toplam 3 kez) uygulanır. Tindalizasyon işleminde 80 0C’de 1 dakikalık ısıtma ve hızla soğutma uygulaması sporların germinasyonu (vejetatif hale geçmesi) için gereklidir. 80 oC kritiktir ve bu amaçla mikrodalga fırın kullanılmaz.
Besiyeri ya da çözeltinin 30 dakika kaynatılması ile bakterilerin spor formu dışındaki tüm mikroorganizmalar öldürülür. Bekleme süreleri ve termal şok ile bakteri sporları vejetatif hale geçer. Ardından tekrar kaynatma ile bunlar da öldürülür. Son bekleme ve kaynatma, sterilizasyon güvenliği için uygulanır.
Doymuş Su Buharında Tutma
Bu yöntem özellikle kaynar su banyosuna daldırılamayacak materyaller içindir. Bu amaçla doymuş su buharı elde edilen özel kazanlardan yararlanılır. Sterilizasyon için 100 °C’de yaklaşık 90 dakikalık süre yeterli olmaktadır. Ancak sterilizasyon süresi sterilize edilecek materyalin hacmine bağlıdır (100-600 ml aralığı 90 dakika, 601-5000 ml 105–120 dakika, 5 litre üzeri 120–150 dakika).
Katı ve sıvı yağlar gibi suda çözünmeyen bazı maddeler buhar ile sterilize edilemez; çünkü buhar sıcaklığı bunların içine nüfuz edemez.
Basınçlı Buhar (Otoklav) ile Sterilizasyon
Basınçlı buhar ile sterilizasyon otoklav denen aletlerde uygulanır. Otoklavda yüksek ısı, nemli ortam ve basınç altında bozulmayacak malzeme ve besiyerleri steril edilir. Mikroorganizmaların ölümü basınçtan değil, yüksek ısıya bağlı protein denaturasyonu yüzündendir.
Genellikle 121°C’de 1,5 atmosfer basınç altında 15 dakika bekletilerek sterilizasyon işlemi yapılır. Malzemenin özelliğine göre bazı durumlarda 134 °C’de 2 atmosfer basınç altında 3–5 dakika, 115 °C’de 1 atmosfer basınç altında 45 dakika bekletilerek de sterilizasyon yapılabilir. Katı materyallerin sterilizasyonunda (toprak vs), otoklavlama süresi sıvılara göre biraz daha uzun tutulmalıdır.
Vida kapaklı şişeler gevşek olarak kapatılıp otoklavlanır ve işlem sonunda otoklav açıldığında kapaklar sıkılır. Eğer besiyeri çok sıcak iken kapaklar sıkılırsa vakum oluşur ve şişe açılırken dışarıdan hava emmeye bağlı olarak kontaminasyon oluşabilir. Bu nedenle vidalı kapaklar, besiyerinin sıcaklığı yaklaşık 50 0C ‘ye soğuduğu zaman sıkılır.
Tüm bu bilgiler çerçevesinde otoklavda sterilizasyon için dikkat edilmesi gereken noktalar aşağıda özetlenmiştir:
Farklı hacimler mümkün olduğu kadar beraber otoklavlanmamalıdır. Fakat günlük uygulamada farklı hacim ve bileşenlerdeki besiyerlerini ayrı ayrı otoklavlamak her zaman mümkün olmayabilir bu durumda hacmi en büyük olan kaba göre sıcaklık ve süre belirlenir.
Otoklavlama süresi çözeltinin hacmi, kullanılan cam kapların çeper kalınlığı, çözeltinin içerdiği maddelerin ısı iletim gücüne (besiyerinin agarlı olup olmaması gibi) göre belirlenmelidir.
Besiyeri hazırlandıktan sonra hemen sterilize edilmelidir. Hazırlanmış besiyerlerlerinin en geç 1 saat içerisinde sterilizasyonuna başlanmış olmalıdır.
Tüm besiyerleri ısıya duyarlı olan pepton ya da ekstraktları içerir; bu nedenle aşırı ısı girişinden kaçınılmalıdır.
Her sterilizasyon için tarih, başlama sıcaklığı, sterilizasyon sıcaklığına ulaşma ve bu sıcaklıkta tutulma sürelerini gösteren kayıtlar tutulmalıdır.
Kullanılacak besiyerleri ile kullanılmış ve yıkama öncesi sterilize edilecek besiyerleri aynı anda otoklavlanmamalıdır.
Otoklavdan alet ve malzeme paketlerinin kuru çıkması veya kuruyunca alınması gerekir. Islak paketler kurumadan ellenirse ellerden, havadan, tozdan ya da yüzeylerden gelen mikroorganizmalarla kontamine olabilir ve ayrıca ıslak paketler kolayca yırtılabilir ya da delinebilir.
Otoklavın kazan hacminin en fazla % 70’ i doldurulmalıdır.